以下是經過優化的 siRNA轉染標準操作流程，整合了關鍵參數優化與避坑指南，適用于絕大多數哺乳動物細胞系（貼壁/懸浮），分為 實驗設計、操作步驟、質控要點三部分：

一、實驗設計關鍵點（轉染前必看）

 Day 0：細胞鋪板

1. 消化細胞 → 用wanquan培養基 調整密度 → 每孔接種 0.5mL（貼壁細胞數：5-8×10?；懸浮細胞數：2×10?）  

2. 37℃培養箱放置 16-24h（目標：轉染時匯合度≈40%）  

關鍵細節：  

- siRNA工作液濃度 = 儲存濃度×30（例：20μM儲存液→工作液終濃度≈33nM）  

- 轉染試劑用量參考說明書（RNAiMAX通常 試劑:siRNA體積比=1:1）  

 Day 2：換液與檢測  

1. 轉染后 6h 更換wanquan培養基（高毒性細胞如原代神經元需4h內換液）  

2. 繼續培養 24-72h（基因沉默峰值時間需預實驗確定）  

 三、質控關鍵步驟（決定成敗！）

 1. 轉染效率驗證（必做）

- 方案1：轉染 FAM標記siRNA → 24h后熒光顯微鏡觀察（效率＞80%合格）  

- 方案2：共轉染 EGFP質粒 → 計算綠色細胞占比（成本低但間接）  

 2. 沉默效果檢測

 3. 細胞毒性評估

- MTT法：轉染后24h檢測，存活率應＞85%  

- 形態觀察：懸浮細胞聚團、貼壁細胞空泡化→提示毒性過強  

 四、高頻問題解決方案

五、特殊細胞優化方案

1. 原代細胞：  

   - 轉染試劑：選 DharmaFECT™ Primary 或 jetPRIME®  

   - 方案：轉染前饑餓處理2h（無血清培養基）→ 復合物孵育時間縮短至5min  

2. 懸浮細胞：  

   - 試劑：Neofect™ DNA/RNA Transfection Reagent  

   - 步驟：離心收集細胞 → 重懸于復合物 → 24孔板每孔接種500μL（密度5×10?/mL）  

3. 難轉細胞（如神經元）：  

   - 專用試劑：NeuroFect™（佐劑提高穿透性）  

   - 轉染后不換液 → 直接補等體積wanquan培養基  

六、試劑耗材推薦表

> 數據標準：合格實驗需滿足——轉染效率＞80% + 沉默效率＞70% + 細胞存活＞85%

避雷總結：  

1. 勿用含抗生素或血清的培養基稀釋復合物（滅活試劑）  

2. 轉染后換液時間寧早勿晚（超8h毒性飆升）  

3. 凍存siRNA避免反復凍融＞3次（分裝儲存-80℃）  

按照此流程操作，可穩定獲得可重復的基因沉默數據！

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